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3-硝基丙酸检测

来源：- 浏览：652 更新时间：2011年12月02日

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3-硝基丙酸（β-Nitropropionic acid）是曲霉属和青霉属的少数菌种产生的有毒代谢产物，在某些高等植物中也有3-硝基丙酸存在。我国从变质甘蔗中分离到的甘蔗节菱孢、蔗生节菱孢等菌种具有产生3-硝基丙酸的能力。3-硝基丙酸是流行于我国河北、河南、山东、山西、新疆、青海、宁夏、辽宁等13个省的变质甘蔗中毒的病因，该中毒症的主要表现为中枢神经系统受损。急性期的症状有呕吐、眩晕、阵发性抽搐、眼球偏侧凝视、昏迷，甚至死亡，后遗症主要为锥体外系的损害，主要症状有屈曲、扭转、痉挛，肢体强直，静止时张力减低等。
3-硝基丙酸为白色结晶化合物，溶于水、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、乙醚和热的三氯甲烷，不溶于石油醚和苯。其化学结构式如下：

图31-1 3-硝基丙酸的化学结构式
目前国外测定3-硝基丙酸的方法有薄怪色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法等。我国建立了测定3-硝基丙酸的薄层色谱法。
一、适用范围
本方法适用于甘蔗中3-硝基丙酸的测定。
二、原理
样品中的3-硝基丙酸经提取，净化及浓缩，点样液于硅胶薄层板上，展开后喷以3-甲基-2-苯并噻唑啉酮水合盐酸盐（MBTH）显色剂，在长波紫外光灯下显示黄色荧光点，利用目视定量或薄层扫描仪测定其含量。
三、试剂
以下试剂均为分析纯。
（一）乙酸乙酯、三氯甲烷、苯、冰乙酸。
（二）无水硫酸钠、2％碳酸氢钠、85％磷酸，6mol/L盐酸。
（三）硅胶G。
（四）显色剂：0.5％MBTH水溶液，置于4℃冰箱保存，每3d重新配制；
（五）展开剂：苯：冰乙酸（9+1，V/V）；确证用展开剂为石油醚：冰乙酸（9+1，V/V）。
（六）3-硝基丙酸标准溶液：精确称取3-硝基丙酸标准品，用乙酸乙酯制成储备液，再将此液用乙酸乙酯稀释成使用液，此标准溶液含3-硝基丙酸20μg/mL，置4℃保存。
四、仪器
（一）岛津CS-910双波长扫描仪及C-EIB微处理机。
（二）减压吹气浓缩装置。
（三）层析槽：内径25cm，宽6cm，高4cm。
（四）喷雾装置：日本岛津公司产。
五、操作步骤
（一）提取和净化
1. 甘蔗样品：取经去皮后切碎挤压得到的甘蔗汁10mL，置于100mL分液漏斗中，用6mol/L盐酸调节pH至2~3，用乙酸乙酯等体积提取三次，合并乙酸乙酯层于另一100mL分液漏斗中，用2％碳酸氢钠溶液30mL和10mL分别提取，振摇2min，静置分层，将水相置于另一100mL分液漏斗中，弃去乙酸乙酯层。用三氯甲烷20mL提取碳酸氢钠层，弃去三氯甲烷层，用6mol/L盐酸调节pH至2～3，用乙酸乙酯40mL、30mL、20mL分别提取，将乙酸乙酯吸出于150mL梨形瓶中，浓缩至干，用少量乙酸乙酯洗瓶壁数次，分别在40～45℃水浴中减压浓缩至干，加1mL乙酸乙酯定容，待测定。
2.甘蔗样品：将市售经冰冻的样品去皮后切碎，取20g置具塞200mL锥形瓶中，加无水硫酸钠20g，混匀，加乙酸乙酯60mL，85％磷酸0.12mL，浸泡30min后，振荡30min，且粗滤纸过滤，取滤液30mL于100mL分液漏斗中。以下按五（一）1“用2％碳酸氢钠溶液”方法操作。
（二）薄层色谱测定
1. 制板：取硅胶G3g，加水10mL，搅成匀浆，涂布于三块5cm×20cm玻璃板上，薄层厚度为0.3mm，干燥后于110℃烘烤3h后，置干燥器中备用。
2. 点板：以薄层板的短边为底边，距底边3cm的基线上用微量注射器滴加10μL标准液（20μg/mL）一个点，10μL样液两个点，在其中一个10μL样液点上再滴加10μL标准液（20μg/mL）。
3. 展开：上行展开16cm，展开剂为苯：冰乙酸（9+1，V/V）。
4. 显色：展开后的薄层板经挥干后，喷以显色剂至刚刚潮湿，置145~150℃烤箱中烘烤15min，冷却后，在波长365nm紫外光灯下目视定量或用薄层扫描仪定量。3-硝基丙酸的Rf值约为0.39。
5. 扫描条件：岛津CS-910双波长薄层扫描仪，用氙灯作光源，在380nm激发波长，500nm发射波长条件下，测量标准与样液斑点的荧光。
6. 目测条件：在波长365nm紫外光灯下观察，结果判定如下：
（1）标准点应出现黄色荧光；
（2）如样液点在标准点相应处未出现黄色荧光，则样品中3-硝基丙酸的含量在测定方法灵敏度以下。如在相应位置上有黄色荧光点，而另一点中样液点与标准点重叠，则为阳性。根据样液点的荧光强度估计减少滴加微升数，或稀释后滴加不同微升数，直至样液点与标准点的荧光强度一致为止。
7. 确证试验：用石油醚：冰乙酸（9+1，V/V）展开至16cm，挥干后显色，再测定，Rf值约为0.23。

（三）计算：

式中：M——样品中3-硝基丙酸的量，μg/g或μg/mL；
0.2——3-硝基丙酸的最低检出量，μg；
V1——加入乙酸乙酯的体积，mL；
V2——出现最低检出量时滴加样液的体积，mL；
D——样液的总稀释倍数。
W——甘蔗取样质量，g；或甘蔗汁取样质量，mL。
本方法的灵敏度为2mg/kg。

来源:医药网-虎网医药-保健品-资讯网 ( 责任编辑:sundy )

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